清华大学生命学院首次体外应用Cas9系统实现对上百kb的基因组片段的靶向克隆

 9月1日，清华大学生命科学学院朱听研究员课题组在《自然-通讯》上在线发表了题为《CATCH技术实现大型基因簇一步法靶向克隆》的论文，首次体外应用Cas9系统实现对上百kb的基因组片段的靶向克隆。

　　分子克隆技术已被广泛应用于现代生物学的各个领域，但传统的PCR（聚合酶链式反应）技术通常很难一步得到15 kb以上的片段，传统的限制性核酸内切酶识别位点仅6-8个碱基，对生物基因组不能有效实现特异性，因此对于较长目标片段的克隆或合成始终存在阳性率低，步骤复杂，成本高等问题。近年来人们在细菌中发现的CRISPR系统可以实现对外源序列的特异性识别和有效切割，在此基础上，科学家们开发出许多基因编辑、基因表达调控，体内成像等工具。然而对该系统的体外应用则鲜有报道。朱听课题组利用体外转录制备的sgRNA和表达纯化的Cas9蛋白特异性酶切目标全基因组，并通过同源序列互补将长达100 kb的目标片段一步连接到细菌人工染色体上实现特异性克隆。通过脉冲场电泳可以清晰观察到目标大片段从全基因上的有效分离，其克隆效率可与普通短片段克隆相当。

　　该技术的开发将极大简化对能够表达具有高附加值生物大分子的基因簇的克隆步骤，节省时间并降低成本，该技术有望广泛应用于合成生物学、基因测序、精准医疗等领域。

　　本课题得到科技部、国家自然科学基金委、清华-北大生命科学联合中心、感染性疾病诊治协同创新中心的经费支持。